Molekularne techniki analizy RNA

• Kategorie:
  1. Ebooki i Audiobooki »
  2. Nauki o zdrowiu »
  3. Biologia, botanika, zoologia
• Język wydania: polski
• ISBN: 978-83-235-1755-9
• ISBN druku: 978-83-235-1232-5
• Liczba stron: 64
• Sposób dostarczenia produktu elektronicznego
  Produkty elektroniczne takie jak Ebooki czy Audiobooki są udostępniane online po uprzednim opłaceniu (PayU, BLIK) na stronie Twoje konto > Biblioteka.

  Pliki można pobrać zazwyczaj w ciągu kilku-kilkunastu minut po uzyskaniu poprawnej autoryzacji płatności, choć w przypadku niektórych publikacji elektronicznych czas oczekiwania może być nieco dłuższy.

  Sprzedaż terytorialna towarów elektronicznych jest regulowana wyłącznie ograniczeniami terytorialnymi licencji konkretnych produktów.
• Ważne informacje techniczne
• Minimalne wymagania sprzętowe:
  • procesor: architektura x86 1GHz lub odpowiedniki w pozostałych architekturach
  • Pamięć operacyjna: 512MB
  • Monitor i karta graficzna: zgodny ze standardem XGA, minimalna rozdzielczość 1024x768 16bit
  • Dysk twardy: dowolny obsługujący system operacyjny z minimalnie 100MB wolnego miejsca
  • Mysz lub inny manipulator + klawiatura
  • Karta sieciowa/modem: umożliwiająca dostęp do sieci Internet z prędkością 512kb/s
• Minimalne wymagania oprogramowania:
  • System Operacyjny: System MS Windows 95 i wyżej, Linux z X.ORG, MacOS 9 lub wyżej, najnowsze systemy mobilne: Android, iPhone, SymbianOS, Windows Mobile
  • Przeglądarka internetowa: Internet Explorer 7 lub wyżej, Opera 9 i wyżej, FireFox 2 i wyżej, Chrome 1.0 i wyżej, Safari 5
  • Przeglądarka z obsługą ciasteczek i włączoną obsługą JavaScript
  • Zalecany plugin Flash Player w wersji 10.0 lub wyżej.
• Informacja o formatach plików:
  • PDF - format polecany do czytania na laptopach oraz komputerach stacjonarnych.
  • EPUB - format pliku, który umożliwia czytanie książek elektronicznych na urządzeniach z mniejszymi ekranami (np. e-czytnik lub smartfon), dając możliwość dopasowania tekstu do wielkości urządzenia i preferencji użytkownika.
  • MOBI - format zapisu firmy Mobipocket, który można pobrać na dowolne urządzenie elektroniczne (np.e-czytnik Kindle) z zainstalowanym programem (np. MobiPocket Reader) pozwalającym czytać pliki MOBI.
  • Audiobooki w formacie MP3 - format pliku, przeznaczony do odsłuchu nagrań audio.
• Rodzaje zabezpieczeń plików:
  • Watermark - (znak wodny) to zaszyfrowana informacja o użytkowniku, który zakupił produkt. Dzięki temu łatwo jest zidentyfikować użytkownika, który rozpowszechnił produkt w sposób niezgodny z prawem.
  • Brak zabezpieczenia - część oferowanych w naszym sklepie plików nie posiada zabezpieczeń. Zazwyczaj tego typu pliki można pobierać ograniczoną ilość razy, określaną przez dostawcę publikacji elektronicznych. W przypadku zbyt dużej ilości pobrań plików na stronie WWW pojawia się stosowny komunikat.

  Więcej informacji o publikacjach elektronicznych

Wstęp      	7

1. Analiza northern – detekcja RNA na filtrach. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży            	9

	Opis i cel doświadczenia            	9

ĆWICZENIE 1. Izolacja całkowitego RNA z różnych organizmów oraz ocena jakościowa uzyskanego preparatu                     	10

Metody izolacji RNA                        	10
RNazy                        	10
Dobra praktyka laboratoryjna                       	11
Inhibitory RNaz                     	11
Przechowywanie RNA                       	12
Ocena jakości RNA                  	12
Izolacja całkowitego RNA z komórek drożdżowych            	13
Literatura                         	14

ĆWICZENIE 2. Elektroforetyczny rozdział RNA w żelu agarozowym i ocena jakości RNA                     	15

Technika northern                      	15
Znakowanie izotopowe                  	15
Znakowanie nieizotopowe                     	15
Detekcja znaczników nieradioaktywnych               	16
Elektroforeza RNA z drożdży w żelu agarozowym w warunkach denaturujących           	16
Transfer kapilarny                       	17

ĆWICZENIE 3. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży – hybrydyzacja         	18

Skład buforów                  	18
Procedura hybrydyzacji                      	18
Odpłukanie nadmiaru sond                      	18
Wizualizacja hybrydyzacji                       	18
Literatura                 	18

2. Analiza northern – wykrywanie transkryptów CUT u drożdży    	20

	Wstęp                         	20
Co to są CUTy?                 	20
Funkcje CUTów                        	21
Literatura                   	21

ĆWICZENIE 4. Elektroforeza RNA w denaturującym żelu poliakrylamidowym       	23

Elektroforeza RNA w 6% żelu poliakrylamidowym z 7 M mocznikiem            	23
Transfer elektryczny mokry                      	23
 
ĆWICZENIE 5. Hybrydyzacja RNA na membranie z sondą radioaktywną specyficzną wobec IGS1-R, wyznakowaną metodą „random-priming”             	24

3. Wykrywanie małych RNA                25

	Wstęp                       	25
Małe interferujące RNA: miRNA i siRNA                	25
Wybrane metody detekcji małych RNA (iRNA)             	26
Literatura                   	28

ĆWICZENIE 4.  Pulsacyjny RT-PCR, cz. 1 – pulsacyjna odwrotna transkrypcja                          	29

Materiały                   	29
Trawienie DNazą                        	29
Pulsacyjna odwrotna transkrypcja               	29

ĆWICZENIE 5. Reakcja PCR – cz. 2                  	31
ĆWICZENIE 6. Rozdział w żelu agarozowym produktów pulsacyjnego RT-PCR         	32

Przygotowanie próbek                     	32

4. Badanie końców cząsteczek RNA na przykładzie drożdżowych prekursorów snoRNA. Technika cRT-PCR              33

	Wstęp                          	33
RNaza H                      	33
Ligacja RNA                   	34
Literatura                   	34

ĆWICZENIE 6. Trawienie RNazą H i ligacja RNA             	35

Trawienie RNazą H                 	35
Ligacja RNA                      	36

ĆWICZENIE 7. Reakcja odwrotnej transkrypcji i PCR            	37

Reakcja odwrotnej transkrypcji              	37
PCR                            	37

ĆWICZENIE 8. Elektroforeza produktów PCR               	38

5. PCR ilościowy: RT-qPCR                  39

	Wstęp                     	39
Formaty detekcji produktów qPCR               	39
Kontrola jakości RNA                       	40
Analiza doświadczeń qPCR                    	40
Najbardziej kluczowe elementy RT-qPCR                    	41
Literatura                   	42

ĆWICZENIE 8. Projektowanie starterów do qPCR – konkurs na najlepszą parę starterów   	43

Wskazówki do projektowania starterów                     	43
Wykonanie ćwiczenia                      	44

ĆWICZENIE 9. Testowanie zaprojektowanych starterów do qPCR        	45

Przygotowanie starterów                      	45
Przygotowanie reakcji qPCR                  	45

ĆWICZENIE 10. Analiza reakcji qPCR                  	46
 
6. Oznaczenia aktywności enzymów biorących udział w obróbce RNA           	47

Oznaczanie aktywności enzymów hydrolizy kapu               	47
Struktura kapu transkryptów polimerazy RNA II                   	47
Hydroliza kapu                         	48
Badanie enzymatycznej hydrolizy kapu                	49
Oznaczanie aktywności endonukleazy Rnt1                 	50
Endonukleazy z rodziny RNazy III                     	50
Rnt1                     	51
Biogeneza sn/snoRNA u drożdży Saccharomyces cerevisiae, rola Rnt1            	52
Literatura                   	53

ĆWICZENIE  11. Analiza aktywności Rnt1 w ekstrakcie drożdżowym         	55

Protokół                    	55

7. Analiza oddziaływania białka z kwasem nukleinowym: test opóźnienia migracji w żelu (EMSA)                58

	Wstęp                        	58
Analiza EMSA                   	58
	Terminacja transkrypcji polimerazy RNA I             	59
Literatura                   	60

ĆWICZENIE  12. Wiązanie Reb1 do IGS1 rDNA in vitro           	61

Badane warianty IGS1 rDNA S. cerevisiae              	61
Wiązanie białka do DNA                  	61
Rozdział w natywnym żelu poliakrylamidowym                   	61

8. Sztuczne microRNA – amiRNA      63

	Wstęp                       	63
Wybrane zalety amiRNA                  	64
Wady amiRNA                          	64
Literatura                   	64

ĆWICZENIE  13. Projektowanie amiRNA             	64